Bilgi

Kültür ortamındaki ölü hücrelerin inkübasyon sırasında Canlı hücreler üzerinde önemli bir etkisi olacak mı?

Kültür ortamındaki ölü hücrelerin inkübasyon sırasında Canlı hücreler üzerinde önemli bir etkisi olacak mı?


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Kararlı hücre hatları oluşturuyorum ve ilgilenmem gereken 25'ten fazla kültür şişesi gibi bir şey var. İdeal olarak, sürekli ortamı değiştirmek için acele etmeden canlı yapışkanla ölü hücrelerin ortamda oturmasına izin verebilirim - Bu, canlı hücrelerin büyümesini etkiler mi - Zaten yüksek[] Higromisin'de oturdukları için onları engellemek istemiyorum


Bunun gerçek ölü hücrelerle bağlantılı olup olmadığından emin değilim, ancak birincil kültürlerden çizgiler oluşturmaya çalışırken plakalardaki ortamı değiştirmemenin kontaminasyona yol açabileceğini buldum. Yine, bunun, kirleticilerin besin türetebileceği ölü hücreler olduğundan mı, yoksa sadece ortam değiştirmenin kirleticileri çok fazla büyümeden uzaklaştırmasından mı kaynaklandığını belirlemedim. Yine de bunu aklınızda tutmak isteyebilirsiniz. Medyayı her 3 günde bir değiştirmenin yeterince iyi olduğunu gördüm.

Ayrıca, hatlarınızı ne için kullanmak istediğinize de bağlıdır. Hücre sinyalleşmesini veya polarizasyonunu incelemeyi umuyorsanız (örneğin bunlar bağışıklık hücreleriyse), ölü materyal bağışıklık hücrelerini aktive edeceği ve sinyal modellerini değiştireceği için bu bir sorun olabilir. Bunun genel büyüme konusundaki endişenizle daha az ilgisi var ve yaptığınız şey için iyi bir model geliştirmenizle daha fazla ilgisi var.

Adil olmak gerekirse, bu sinyal kaymaları kültürdeki çoğalmayı modüle edebilir, ancak bu gerçekten hücre tipinden hücre tipine değişecektir. Biraz belirsiz olduğum için üzgünüm! Sadece tüm hücreler farklıdır - Ben oldukça titiz olan bağışıklık hücreleriyle çalışıyorum. Bununla birlikte, muhtemelen tükürebileceğiniz fibroblastlar gibi çok daha sağlam başka türler de var ve onlar iyi olacak.

Medyayı her 3 günde bir değiştirmek gerçekten çok zahmetliyse, küçük alt kültürleri ayırmayı ve bir mini deney yaparak medyayı değiştirmenin bir hafta kadar sonra birleşmeyi etkileyip etkilemediğini görebilirsin. Bu size hücrelerinizin bu konuda ne kadar esnek olduğunu söylerdi.

Düzenleme: Ölü hücrelerin kültürdeki etkilerini ve hücre türleri arasındaki farklılıkları tartışan bazı yayınlar. Ayrıca, bir hücre hattı kullanıyorsanız, ATCC web sitesi aracılığıyla bilgi aramanızı ve veri sayfalarını ve sitelerinde, hattın nasıl izole edildiğini ve kültür için en iyi uygulamaları açıklayan en iyi referanslardan bazılarını okumanızı da tavsiye ederim.

  1. "Kalıcı apoptotik hücrelerin in vitro monoklonal antikor üretimi üzerindeki inhibitör etkileri" - ölü hücre uzaklaştırma eksikliğinin nasıl iyi bir örnek laboratuvar ortamında hücre fonksiyonunu/fenotipini etkileyebilir ve farklı hücre tipleri arasındaki farkları vurgulayabilir.

  2. "Memeli hücre kültüründe hücre ölümü: moleküler mekanizmalar ve hücre hattı mühendisliği stratejileri" - bahsettiğim gerçek moleküler mekanizmalara değinen iyi bir inceleme. Hücre ölümündeki artışların üretkenlik, büyüme ve hücre sayısı gibi şeyleri nasıl etkileyebileceğini gösteren birkaç birincil kaynağı özetlediği ve bağlantı kurduğu için özellikle "Memeli hücre kültürlerinde hücre ölümünün uyarılması" bölümünü okumanızı tavsiye ederim. Ayrıca, anlaşılması önemli olan, ancak orijinal soru için biraz fazla yabancı olabilecek farklı hücre ölümü türlerine değinmek için de iyi bir iş çıkarıyor.

  3. "Memeli hücrelerinde metabolizma ve apoptoz arasındaki bağlantılar: Anti-apoptoz mühendisliği uygulamaları" - önceki kaynakla benzer şekilde iyi, ancak daha metabolik bir mercekle bakıyor, bunun hücre kültürünün gerçekleri düşünüldüğünde yararlı olduğunu düşünüyorum.


Ölü veya Canlı: Mikrobiyal Canlılığın Moleküler Değerlendirmesi

Tür hedefli PCR'lerden metagenomiklere kadar uzanan nükleik asit bazlı analitik yöntemler, doğal örneklerdeki mikrobiyolojik çeşitlilik anlayışımızı büyük ölçüde genişletmiştir. Ancak bu yöntemler, örneklerdeki mikroorganizmaların aktiviteleri ve fizyolojik durumları hakkında sadece sınırlı bilgi sağlar. En temel fizyolojik durum olan canlılık bile, PCR gibi standart DNA hedefli yöntemlerle kesitsel olarak değerlendirilemez. Toplu olarak moleküler canlılık analizleri olarak adlandırılan yeni PCR tabanlı stratejiler, canlı hücrelerle ilişkili nükleik asitleri inaktive edilmiş hücrelerle ilişkili olanlardan ayırt eden geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin faydasını en üst düzeye çıkarmak ve sonuçları doğru bir şekilde yorumlamak için mikrobiyal dünyadaki yaşam ve ölümün fizyolojik çeşitliliğini göz önünde bulundurmak gerekir. Bu makale, bu bağlamda moleküler canlılık analizini gözden geçirmekte ve genetik, metagenomik ve tek hücreli mikrobiyolojide bu stratejiler için gelecekteki fırsatları tartışmaktadır.


Soyut

Hidrojeller, ayarlanabilir mekanik özelliklere sahip oldukları, farklı hücre tipleri ile uyumlu oldukları ve doğal hücre dışı matrislerde bulunan elementlere benzedikleri için üç boyutlu (3B) doku mühendisliği yapılarının gerçekleştirilmesi için çekici bir malzeme platformunu temsil eder. Şimdiye kadar, tek hücreli kapsülleme yaklaşımı kullanılarak çok sayıda hidrojel-kıkırdak/kemik dokusu mühendisliği (TE) ile ilgili çalışma yapılmıştır. Çok hücreli sferoid kültürler, kıkırdak veya kemik TE için avantajlı özellikler sergilemesine rağmen, hidrojeller içindeki kök hücre mikrosferoidlerinin kondrojenik veya osteojenik farklılaşma potansiyeli çok fazla araştırılmamıştır. Bu çalışma, ilk kez, jelatin bazlı hidrojellerin sertliğinin (538, 3584 veya 7263 Pa depolama modülüne sahip) telomerazdan ölümsüzleştirilmiş insan adipoz türevli kök hücrelerinden (hASC/hASC/ hTERT). Konfokal mikroskopi, test edilen tüm hidrojellerin kontrol, kondrojenik veya osteojenik ortamda 3 ila 5 haftalık kültür periyodu sırasında hücre canlılığını desteklediğini gösterir. Daha yumuşak hidrojellerde, komşu mikrokürelerden hücreler birkaç gün içinde büyümeye ve birbirine bağlanmaya başlasa da, çıkıntıları sırasıyla daha sert hidrojeller veya kondrojenik ortamda kültürlenenlerde daha yavaş veya sınırlıydı. Kondrojenik belirteçlerin yüksek ifadeleri (SOX9, ACAN, COL2A1), test edilen tüm hidrojellerde tespit edilen hASC/hTERT mikrosferoidlerinin kondrojenik farklılaşmasının, özellikle üstün kıkırdak spesifik özelliklerin Alcian mavisi boyama ile doğrulandığı iki yumuşak hidrojelde çok başarılı olduğunu kanıtladı. Bu kondrojenik olarak indüklenen numuneler ayrıca ifade edildi COL10A1, kondrosit hipertrofisinin bir belirteci. İlginç bir şekilde, hidrojelin kendisi (farklılaşma ortamı olmadan) hafif bir kondrojenik indüksiyon gösterdi. Hidrojel sertliğinden bağımsız olarak, osteojenik ortam ile uyarılan örneklerde, seçilen belirteçlerin ifadesi RUNX2, BGLAP, ALPL, ve COL1A1 kesin değildi. Bununla birlikte, von Kossa boyaması, iki daha yumuşak hidrojelde osteojenik olarak uyarılan örneklerde kalsiyum birikintilerinin varlığını doğruladı ve bunların da osteogenezi desteklediğini öne sürdü. Bu gözlem, osteojenik olarak indüklenen hidrojellerde kontrollerine göre daha yüksek miktarlarda kalsiyumun tespit edildiği Alizarin kırmızı miktar tayini ile de doğrulandı. Sunulan veriler, jelatin bazlı hidrojellerde adipoz türevli kök hücre mikrosferoidlerinin kapsüllenmesinin, kıkırdak veya kemik TE'de gelecekteki uygulamalar için umut verici bir potansiyel gösterdiğini göstermektedir.


Çoğu hücre, 7.2-7.4 aralığında pH koşulları gerektirir ve optimum kültür koşulları için bir tamponlama sistemi tarafından pH'ın yakın kontrolü esastır. Bu optimumun büyük varyasyonları vardır, fibroblastlar daha yüksek bir pH'ı (7.4-7.7) tercih ederken, sürekli dönüştürülmüş hücre hatları daha asidik koşullar gerektirir.

pH'ın düzenlenmesi, yeni bir kültür kurulduğunda hücre tohumlamadan hemen sonra özellikle önemlidir ve genellikle iki tamponlama sisteminden biri ile sağlanır (i) gaz halinde CO2'nin bulunduğu “doğal” bir tamponlama sistemi.2 CO ile dengeler3/HCO3 kültür ortamının içeriği ve (ii) HEPES adı verilen bir zwitterion kullanılarak kimyasal tamponlama.

Doğal bikarbonat/CO kullanan kültürler2 tamponlama sistemlerinin %5-10 CO2 atmosferinde tutulması gerekir2 genellikle bir CO ile sağlanan havada2 kuluçka makinesi. Bikarbonat/CO2 düşük maliyetlidir, toksik değildir ve ayrıca hücrelere başka kimyasal faydalar sağlar.

HEPES, pH 7.2-7.4 aralığında üstün tamponlama kapasitesine sahiptir, ancak nispeten pahalıdır ve daha yüksek konsantrasyonlarda (yukarıda) bazı hücre türleri için toksik olabilir.

100 nM). HEPES tamponlu kültürler, kontrollü bir gazlı atmosfer gerektirmez.

Çoğu ticari kültür ortamı, bir pH göstergesi olarak fenol kırmızısı içerir, böylece ortamın pH durumu sürekli olarak renkle gösterilir. Renk sarıya (asidik) veya mora (bazik) dönerse kültür ortamı genellikle değiştirilmeli/yenilenmelidir.


Hücreleri İzole Etmenin Daha Etkili Bir Yolu

Verimli çalışan bilim adamları, daha az zamanda ve daha az çabayla daha fazlasını başarır. Güvenilirlik, saflık veya iyileşmeden ödün vermeden daha az zaman ve çaba harcayan hücreleri izole etmenin daha akıllı bir yolunu geliştirdik.

Verim

Verimlilik, numune hacmi, hücre sayısı veya numune sayısı açısından hücre izolasyonunun tamamlanabileceği hızı ifade eder. Bir hücre ayırma deneyinde kaç hücre izole edebilirsiniz? Aynı anda kaç örnek işleyebilirsiniz? Aynı anda büyük numune hacimleriyle veya birden fazla numuneyle çalışıyorsanız, hangi hücre izolasyon teknolojisinin istediğiniz verimi destekleyebileceğini düşünmek isteyeceksiniz.

Kullanım kolaylığı

Kullanım kolaylığı, özellikle yeni kullanıcılar için hücre ayırma yönteminin güvenilirliğine ve tekrarlanabilirliğine katkıda bulunur. Bir örnekte, Bolivya And Dağları'na yapılan bir keşif gezisindeki gönüllüler, hücre ayrımı konusunda hiçbir deneyimi olmamasına ve laboratuvar ekipmanına sınırlı erişime sahip olmalarına rağmen, yüksekliğin bağışıklık sistemi üzerindeki etkisini incelemek için hücreleri izole edebildiler. Basit hücre izolasyon protokolleri, kullanıcı hatalarını ve değişkenliği azaltmada kilit rol oynadı.

Numune ve Hücre Tipleri

Numune ve hücre türleri, hangi hücre ayırma teknolojilerinin size uygun olduğunu belirleyebilir. Örneğin, fare akciğerlerinden ILC'lerin izolasyonu için ticari olarak temin edilebilen bir immünomanyetik hücre izolasyon kiti vardır, ancak yağ dokusundan Th2 hücrelerinin izolasyonu için optimize edilmiş bir kit olmayabilir. Ayrıca, çalıştığınız numune hacmi, uygulamanız için mevcut hücre ayırma teknolojilerini de sınırlayabilir.

Bazı durumlarda, tek bir örnekten birden çok hücre türünü izole etmek isteyebilirsiniz. Bazı hücre izolasyon yöntemleri ve teknolojileri, sıralı hücre ayırma gerçekleştirmenize olanak tanır.

Özellikle araştırma finansmanınız sınırlıysa, karar verirken maliyet genellikle ön plandadır. Herhangi bir hücre ayırma yönteminin maliyetini değerlendirirken, reaktifler (örn. antikorlar, manyetik parçacıklar ve yoğunluk gradyan ortamı), tek kullanımlık malzemeler (örn. tüpler, tüpler ve kolonlar) ve zaman ve hizmet (örn. akış sitometrisi) dahil tüm maliyetleri dahil etmeyi unutmayın. çekirdek tesis rezervasyonları). Maliyet tasarrufu performanstan ödün vermemelidir.

Otomasyon

Otomasyon, değişkenliği azaltabilir, gereken uygulamalı çalışma süresini sınırlayabilir ve laboratuvarda geçirdiğiniz zamandan daha fazlasını yapmanıza olanak tanır. RoboSep™ gibi otomatik hücre ayırma cihazları, potansiyel olarak enfeksiyöz numunelerle çalışırken tehlikeli patojenlere maruz kalma riskini de azaltır.


3. SONUÇLAR

3.1 Kürelerin boyut gelişimi

Daha önce açıklandığı gibi (Metzger ve diğerleri, 2011 , 2013), LOT, oldukça standart koşullar altında boşluk başına tam olarak bir sfero üretmek için hem güçlü hem de kolay bir tekniktir. Sferoidlerin boyutu, boşluk başına 100 ul'lik tohumlama hacmini sabit tutarken tohumlama süspansiyonundaki hücresel konsantrasyonları ayarlayarak kolayca belirlenebilir (Şekil 2). Küreler, nesilden sonraki 1. Günde bile düzenli bir yuvarlak morfoloji sergilediler ve hemen hemen tüm tohumlanmış hücreler sferoide entegre edildi. Unutulmamalıdır ki, ortak kültür sferoidlerinin morfolojisi, mono-kültür sferoidlerine kıyasla biraz daha düzensizdi. Ayrıca, ortak kültür küreleri, 3. ve 6. Günlerde 50.000 hücreden oluşan ortak kültür küreleri için açıkça görülebilen daha fazla hücresel enkaz ile çevriliydi.

Farklı hücresel bileşimlere sahip sferoid boyutunun geliştirilmesine ilişkin daha önce yayınlanmış sonuçlarımıza uygun olarak (Metzger ve diğerleri, 2011), araştırılan tüm sferoidlerin boyutu zaman içinde sürekli olarak azaldı (Şekil 3a ve 4a). Şekil 3a ve 4a'da sunulan çok küçük standart sapmalar, LOT'un performansını etkileyici bir şekilde vurgulamaktadır.

3.2 Tek hücrelere ayrışma başarısı

Önerilen ayrışma protokolü, standartlaştırılmış koşullar altında mono ve kokültür kürelerinin başarılı bir şekilde ayrılmasına izin verdi. Bu koşulları kürelerin boyutuna veya yaşına göre değiştirmek gerekli değildi. Tüm sferoidler, kesme kuvvetleri yaratan müteakip bir pipetleme prosedürü ile desteklenen AccuMax içinde 37°C'de sürekli çalkalama altında 10 dakika içinde ayrılabilir. Enzimatik ayrışmanın başarısı ilk olarak mikroskobik olarak kontrol edildi ve hücre süspansiyonu 70 µm'lik ön ayırma filtrelerinden geçirildikten sonra bulunamayan sadece birkaç hücresel küme ortaya çıktı. Ek olarak, filtrelerde nihai olarak tüm kalıcı kümelerin yeterince gevşetilebileceğini gösteren hiçbir hücresel küme bulunamadı. LUNA FL hücre sayacı, tekli hücrelerin sayısının ölçülmesine izin verdi ve tüm sferoidler için en az %95 tek hücre ortaya çıkardı (Şekil 4, 3b,c ve 4b,c). NHDF için, farklı boyutlardaki sferoidler arasında bazı farklılıklar saptanabilirdi: 50.000 hücreden oluşan NHDF sferoidleri, 1. Gün ve 3. Gün'de biraz daha düşük miktarda tek hücre ortaya çıkardı. Ortak kültür için tek hücre miktarı üzerinde neredeyse hiçbir etki bulunamadı. sferoidler (Şekil 4b,c). Şekil 3c ve 4c'de alternatif bir karşılaştırmayı gösteren bu sonuçların ek sunumu, sferoidlerin yaşının etkisine odaklanmaktadır. İlgi çekici bir şekilde, 50.000 hücreden oluşan hem mono- hem de ortak kültür sferoidleri için tek hücre sayısında bir artış tespit edilebilir. Mono ve ortak kültür sferoidleri için elde edilen sonuçların doğrudan karşılaştırılması, ortak kültür sferoidlerinin çoğu için önemli ölçüde azaltılmış tek hücre sayısını ortaya çıkardı (3. Gün ve 6. Gün 50.000 hücre 1. Gün, 3. Gün ve 6. Gün 10.000 hücre 5000 hücre 3. Gün).

3.3 Akış sitometrik canlı-ölü-tahlili ve enkaz miktar tayini

Hücrelerin herhangi bir akış aşağı uygulaması için, sferoidlerin ayrılmasından sonra hücrelerin canlılığı son derece önemlidir. Bir yandan AccuMax'te inkübasyon süresi oldukça kısadır (10 dakika), diğer yandan tekrarlanan santrifüjleme ve sıkı pipetleme ile uygulanan kesme kuvvetlerinin etkisi hücrelerin canlılığının bozulmasına neden olabilir. Şekil 3d, e ve 4d, e'de gösterildiği gibi, akış sitometrik niceleme ile kombinasyon halinde canlı-ölü tahlili ile belirlenen ayrışmadan sonra hücrelerin canlılığı çoğu durumda %85 ile %95 arasındaydı. En düşük canlılık, %80,1 ile 1. Günde kokültür sferoidleri (10.000 hücre) için tespit edildi. Şekil 3d ve 4d'de gösterilen farklı küresel boyutların karşılaştırılması için sadece küçük farklılıklar görülebildi. Ayrıca, sferoidlerin yaşının canlılık üzerinde sadece küçük bir etkisi vardır (Şekil 3e ve 4e). Bazı durumlarda, 3. Günde en yüksek sayıda canlı hücre eğilimi görülebilir, ancak farklılıklar yalnızca kısmen önemlidir. Bununla birlikte, mono- ve ortak kültür sferoidleri arasındaki doğrudan karşılaştırma, seçilen hücre tipinin, ayrışmadan sonra canlılıkları üzerinde güçlü bir etkisi olduğunu ortaya çıkardı: Hemen hemen tüm gruplar için, NHDF-HDMEC-kültür küreleri, mono-kültür sferoidlerinden önemli ölçüde daha az canlı idi. Sadece 6. Günde, 5000 hücre ve 50.000 hücreden oluşan sferoidler için hiçbir fark görülmedi.

Bu bulgular doğrultusunda, akış sitometrisi ile ölçülen hücresel enkaz miktarı, 3. ve 6. Günlerde ayrışmış kokültür küreleri için açıkça artarken, NHDF-mono kültür küremsileri için enkazda bir artış gözlenmedi (Şekil 5). Mono ve ortak kültürler arasındaki enkaz miktarının doğrudan karşılaştırılması, 3. ve 6. Günlerde ortak kültürler için önemli ölçüde daha fazla enkaz ortaya çıkardı.

3.4 Apoptotik hücrelerin akış sitometrik ölçümü

Şekil 3f,g ve 4f,g, akış sitometrisi aracılığıyla Kaspaz-3 pozitif hücrelerin miktarının belirlenmesinin sonuçlarını gösterir. İlk bakışta, ayrışmış mono-kültür sferoidleri için düşük sayıda apoptotik NHDF açıktır. 6. Günde bile, en büyük sferoidler %2'den az apoptotik hücre sergiledi. Not olarak, zamanla apoptotik hücrelerde yalnızca küçük bir artış tespit edilebilir (Şekil 3f,g). Buna karşılık, ortak kültür sferoidleri için oldukça yüksek sayıda apoptotik hücre bulduk ve neredeyse %18'e ulaştık (Şekil 4f,g). Hem ayrışmış mono- hem de ortak kültür küreleri için, apoptotik hücrelerin sayısı kürelerin boyutundan etkilenmez (Şekil 3f ve 4f), ancak kürelerin yaşından etkilenir, bu da ortak kültür küreleri için etkileyici bir şekilde görülebilir. Tüm durumlarda, apoptotik hücre sayısı, ilgili mono-kültür sferoidleri ile karşılaştırıldığında ayrışmış kültür-küreciklerinde daha yüksekti.

3.5 Çoğalan hücrelerin akış sitometrik ölçümü

Nesilden sonraki 1. Günde, hem mono- hem de ortak kültür sferoidlerinde şaşırtıcı derecede yüksek sayıda Ki67 pozitif hücre bulunabilir (Şekil 3h ve 4h). İlgi çekici olan, daha küçük sferoidlerle karşılaştırıldığında 50.000 hücreden oluşan her iki sferoid grubunda daha fazla hücre proliferatifti. Ancak zaten nesilden sonraki 3. Günde, yüksek sayıda Ki67 pozitif hücre önemli ölçüde azaldı ve 6. Günde artık neredeyse hiç çoğalma tespit edilemedi (Şekil 3i ve 4i). Çoğu durumda, Ki67 pozitif hücre sayısı, tek kültürlü sferoidlerde, kültür kültürü sferoidlerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksekti.


4. Adım: Optimize Edin

Arka planı en aza indirin ve floresan sinyallerinin fotostabilitesini koruyun.

Sinyal-arka plan oranı, hücre dışı floresansı azaltan ve florofor fotostabilitesini artıran reaktifler kullanılarak optimize edilebilir. Canlı hücre görüntüleme deneylerinde arka plan floresansını azaltırken veya ortadan kaldırırken hücre sağlığını korumak için özel olarak tasarlanmış ortamlarda görüntü almak önemlidir (bkz. tablo 1). Canlı hücrelerle uyumlu bir arka plan baskılayıcının eklenmesi, hücre dışı arka plan floresansının azaltılmasına ve bir yıkama adımı ihtiyacını ortadan kaldırmaya da yardımcı olabilir. Canlı hücreler için solmaya karşı koruma ortamı, floroforların ışıkla ağartılmasını azaltmak ve çoklu veya uzun pozlamalarda sinyal kaybını önlemek için numunelere uygulanabilir.

Tablo 1. Görüntüleme ortamı karşılaştırması.

Ürünün öne çıkan özellikleri

    mavi, yeşil veya kırmızı kanallarda yüksek arka plan sinyali veya zayıf floresan gözlemlendiğinde kullanılır. floroforun fotostabilitesini arttırmak için kullanılır. uzun süreli inkübasyonun gerekli olmadığı hücre yıkama ve kısa süreli görüntüleme için idealdir. görüntüleme, boya yükleme ve yıkama adımları için kullanılan optik olarak berrak bir çözümdür. Hücreleri 4 saate kadar sağlıklı tutmaya yardımcı olur.

Tubulin Tracker Green boyası ve Tubulin Tracker Deep Red boyası ile etiketlenmiş canlı HeLa hücreleri. Prob boyama solüsyonunda (solda) bırakıldığında her iki etiket de yüksek hücre dışı arka plan gösterir. BackDrop Background Suppressor'ın eklenmesi, hücre içi etiketlemeyi etkilenmeden bırakırken (sağda) hücre dışı arka planı büyük ölçüde azaltır, böylece canlı hücrelerde tübülinin yüksek kontrastlı görüntülemesi için yıkamasız bir protokol sağlar.

ProLong Live reaktifi tarafından sunulan genel sinyal korumasıişlem görmemiş numunelerle karşılaştırma, işlem görmüş ve işlem görmemiş numunelerin EC50 değerine ulaştığı tarama sayısına göre hesaplanır. ProLong Live reaktifinin eklenmesi, Invitrogen CellLight Mitokondriya-RFP reaktifi ile %100 daha fazla yakalamaya izin verdi.

Standart bir hızlandırılmış görüntüleme protokolü kullanılarak 120 pozlamadan sonra, ProLong Live reaktifi ile işlenen numuneler, işlenmemiş hücrelere göre >%20 daha parlaktır ve daha fazla veri toplama süresi sağlar.

  • Başka bir kültür planlanmıyorsa, bulanıklığı azaltarak ve kontrastı artırarak sinyali optimize etmek için bir arka plan baskılayıcı kullanılabilir.
  • Solmaya karşı bir reaktifin kullanımının, çeşitli numune tiplerinde florofor fotostabilitesini arttırdığı ve fototoksisitenin etkisini azalttığı gösterilmiştir.

Yöntemler

Antikorlar ve reaktifler

Şeker bazlı hücre taşıma solüsyonu (SBTS), yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı karbonhidratların (HemSol™) toksik olmayan tescilli bir karışımıdır. Creatv Microtech'ten (Rockville, MD) CellSieve™ CTC mikro filtreleme sistemi, daha önce açıklandığı gibi [42-44] boyut dışlama, >7 mikrona dayalı olarak CTC'leri izole eden düşük basınçlı bir vakum sistemi kullanır. CTC'lerde kullanılan boyalar, CellTracker™ Blue CMAC canlı hücre boyasıydı (Thermo-Fisher). FITC etiketli Pan-sitokeratin klonu C11 (Sigma), insan sitokeratinleri 4, 5, 6, 8, 10, 13 ve 18'i tanır. Fikoeritrin (PE) etiketli anti-insan epitel hücre yapışma molekülü (EpCAM), klon 1B7 (eBioscience) . Alexa Fluor® 594 etiketli anti-insan CD45, klon 2D1 (Novus) ve DRAQ5™ floresan DNA probu (Thermo-Fisher). Pozlama süreleri (ve Leica mikroskop filtrelerinin ex/em dalga boyları) sırasıyla: Mavi CMAC: 35 msn, (350 nm/460 nm) FITC-CK, 500 msn (470 nm/525 nm) PE-EpCAM, 500 msn (546 nm/585 nm) Alexa Fluor594 500 msn (594 nm/645 nm) . DRAQ5 600 msn (640 nm/690 nm). Örnekler bir Leica floresan mikroskobu kullanılarak analiz edildi ve bir Leica kamera ve Leica Microsystems görüntüleme yazılımı ile görüntülendi.

Hücre hatları, birincil hücreler ve kan örnekleri

Çin hamsteri yumurtalık hücreleri (CHO), insan embriyonik böbrek hücreleri (HEK 293), insan göbek damarı endotel hücreleri (HUVEC) ve insan epitelyal kolorektal adenokarsinom hücreleri (CACO-2) insan meme kanseri epitel hücreleri (MCF-7) birincil insan hücreleri ATCC'den satın alındı. Periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC'ler), üretici tarafından tarif edildiği gibi Ficoll ayırma (GE Healthcare) kullanılarak sağlıklı gönüllülerden alınan tam kan örneklerinden izole edildi. Sağlıklı gönüllü kan örnekleri, imzalı bilgilendirilmiş onam ve Batı IRB tarafından IRB onayı ile alındı. Hasta kan örnekleri, imzalı bilgilendirilmiş onam ve Inova Fairfax Hastanesi ile bir IRB ile toplandı.

HemSol™ taşıma solüsyonu ile hücrelerin ve hücre hatlarının inkübasyonu

Primer insan hepatositleri, B-Hücreleri, böbrek hücreleri, mezenkimal kök hücreler ve küçük hücreli olmayan (NSC) akciğer karsinomu ile HemSol™ koruma deneyleri AscentGene Inc. (Gaithersburg, MD) ile işbirliği içinde gerçekleştirilmiştir. HemSol™ ile tedaviden önce yaklaşık 105 –107 hücre kendi büyüme ortamlarında tutuldu. Canlı hücreler, tripan mavisi hariç tutularak numaralandırıldı. Hücreler daha sonra 1X HemSol™ nihai konsantrasyonu için konsantre HemSol™ (2-6X) ile karıştırıldı. Hücreler daha sonra belirtilen süre boyunca ortam sıcaklığında çözelti içinde saklandı, ardından HemSol™ ilgili hücre ortamı kullanılarak yıkandı ve canlı hücreler tripan mavisi dışlama kullanılarak belirlendi ve Tablo 1'de not edildi.

HemSol™ taşıma solüsyonu ile normal tam kana eklenen MCF-7 hücrelerinin analizi

İnsan meme kanseri hücre dizisi (MCF-7) üreticinin protokollerine göre CellTracker™ Green (Invitrogen) ile etiketlendi ve hücreler daha sonra kalan serbest boyayı çıkarmak için yıkandı. CellTracker™ Green, yalnızca canlı hücreleri etiketleyen ve hücre soyları tarafından tutulan hücre içi bir lekedir ve çok nesilli izlemeye olanak tanır. Yaklaşık 10.000 etiketli MCF-7 hücresi, 8 ml normal tam kana ilave edildi. Bu kan örneğinin 4 ml'si daha sonra HemSol™ ile karıştırıldı ve 4 ml'si HemSol™ olmadan oda sıcaklığında 4 gün inkübe edildi. İnkübasyondan sonra kan süzüldü ve filtreler DMEM, 37 °C'de %10 serum, %5 CO2 ile doku kültürüne yerleştirildi.2 ve kültürde 3 gün sonra görüntülendi. İkinci bir etiketli MCF-7 hücresi seti, oda sıcaklığında 7 gün boyunca tam kanda tutuldu, ardından daha önce tarif edildiği gibi [42-44] ve görüntülendiği gibi Creatv Microtech'in CellSieve™ CTC mikro filtrasyon sistemi kullanılarak süzüldü.

HemSol™ taşıma solüsyonu ile inkübe edilen kanser hastası kan örneklerinin analizi

HemSol™'de canlı CTC'lerin korunmasını belirlemek için 1 meme kanseri hastasından, 1 pankreas kanseri hastasından ve 1 akciğer kanserli hastadan alınan çift tam kan numuneleri (7.5 mi) EDTA vakumlu kaplara toplandı ve bir tüpün içeriği hemen 15 6X konsantre HemSol™ içeren, kanla 1X HemSol™'e seyreltilmiş ve tam dağılma için karıştırılmış ml konik tüp. Çift kan örneği, konsantre HemSol™ ile aynı hacimde PBS içeren konik bir tüpe aktarıldı ve benzer şekilde karıştırıldı. Kan numuneleri, çalkalanmadan oda sıcaklığında 6 gün tutuldu ve daha sonra numuneler 1:1 oranında PBS ile karıştırılarak ve numuneler Ficoll üzerine yerleştirilerek fraksiyonlandı. Örnekler, üreticinin talimatlarına göre 50 mL santrifüj tüplerinde 18 °C'de 400 x g'de 30 dakika santrifüjlendi. HemSol™, kırmızı kan hücrelerinin PBMC buffy coat tabakasından yoğunluk ayrımına müdahale etmedi. Toplanan buffy coat tabakası, santrifüjleme ile peletlendi ve üreticinin talimatlarına göre oda sıcaklığında 45 dakika boyunca CellTracker™ Blue CMAC Dye hücre canlı lekesi (Invitrogen) ile 1 ml PBS içinde yeniden süspanse edildi. İnkübasyondan sonra, bağlanmamış boya, santrifüjleme ve hücre peletinin 2 ml PBS içinde yeniden süspanse edilmesi ve ardından yeniden santrifüjleme yoluyla çıkarıldı. Elde edilen hücre peleti daha sonra %1 paraformaldehit (PFA), 5 mM EDTA içeren PBS içinde yeniden süspanse edildi ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. Fiksasyondan sonra hücreler, 5 ml/dakika akış hızına ayarlanmış CellSieve™ mikro filtrasyon sistemi (Creatv Microtech) [42–45] kullanılarak süzüldü. Yakalanan hücreler daha sonra PBS içinde %0.4 Triton X-100 içeren PBS ile geçirgenleştirildi, iki kez 4 ml PBS ile yıkandı ve daha önce tarif edildiği gibi boyandı [42–45].


Teşekkür

Kısmi konfokal veri toplamaları için Jie Gao'ya, elektrofizyolojik kayıt yardımı sağladığı için Guanlong Guo'ya ve diğer Xiaoyu Xu laboratuvar üyelerinin yararlı tartışmaları için teşekkür ederiz. Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (No. 81473549), Chongqing Lisansüstü Araştırma Yenilik Projesi (CYS18098) ve Merkez Üniversiteler için Temel Araştırma Fonları (XDJK2020D037) tarafından desteklenmiştir. Finansörlerin veri toplama ve analizinde, yayınlama kararında veya makalenin hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.


Videoyu izle: Viral Hastalıkların Teşhisi I (Temmuz 2022).


Yorumlar:

  1. Tinashe

    böyle bir blogla işinde iyi şanslar :)

  2. Aladdin

    Evet, mantıklı bir şekilde doğru

  3. Bama

    Soruyu kaldırdım



Bir mesaj yaz